hrvatski

Fluorescentna proba za aktivni oblik GTPaze Rac1A je lokalizirana na mjestima polimerizacije aktina u stanicama D. discoideum

Rac1A pripada obitelji monomernih Rho GTPaza ključnih za regulaciju aktinskog citoskeleta. S ciljem rasvjetljavanja uloge Rac1A u protistu D. discoideum, odlučili smo kreirati fluorescentnu probu koja bi specifično vezala aktivni oblik te GTPaze. Obzirom na veliku srodnost Rac GTPaza iz Dictyostelium-a, za odabir proteinske domene specifične za aktivni Rac1A korišten je sustav dva hibrida u kvascu kojim su testirane interakcije 4 potencijalna partnera s 11 Rac proteina. Odabrali smo DGAP1, protein srodan IQGAP proteinu, koji veže aktivni Rac1A u tetramernom kortikalnom kompleksu. Također smo testirali i njegovu GBD (GTPase binding domain) domenu. Osim toga, testirali smo još dva efektora Rac proteina specifična po tzv. CRIB (Cdc/Rac interactive binding) motivu ; PBD (p21-binding domain) domenu iz Dictyostelium kinaze PAKa i GBD domenu iz štakorske kinaze PAK1. Samo je posljednja reagirala s Rac1A u strogim uvjetima selekcije sustava dva hibrida u kvascu i jedina nije interagirala s konstitutivno neaktivnim oblikom. Nakon što je interakcija štakorske PAK1_GBD s Rac1A potvrđena afinitetnim pročišćavanjem pomoću glutation-sefaroze, ova je domena N-terminalno fuzionirana s YFP i eksprimirana u divljem tipu stanica. U nepokretnim stanicama proba je bila lokalizirana u korteks, dok je kod stanica u kretanju uvijek bila smještena u vodeći rub stanice. Tijekom fagocitoze i makropinocitoze lokalizirala je u endocitotsku čašicu, dok jedino u citokinezi nije imala naglašenu lokalizaciju.

Dictyostelium; Rac1; GTPaza; citoskelet; aktin

nije evidentirano